La cromatografía es uno de los métodos para separar sustancias. Se utiliza para el posterior análisis cualitativo y cuantitativo de las propiedades físicas y químicas de las micropartículas. Una variación de esta tecnología es la cromatografía de afinidad. La idea de diferenciar compuestos proteicos utilizando la propiedad de afinidad molecular se conoce en la ciencia desde hace varias décadas. Sin embargo, ha recibido su desarrollo solo en los últimos años, después de la introducción de materiales hidrofílicos altamente porosos utilizados como matriz. Este método permite resolver tanto problemas analíticos (separación de sustancias y su identificación) como preparativos (purificación, concentración).
Esencia
La cromatografía de afinidad (del latín affinis - "adyacente", "relacionado") se basa en interacciones de afinidad, que son la formación de enlaces altamente específicos entre una molécula espaciadora (ligando o afín) y una molécula diana. Estos mecanismos son de naturaleza generalizada (conexión de mediadores u hormonas y receptores, anticuerpos yantígenos, hibridación de polinucleótidos y otro tipo de procesos). En medicina, la cromatografía de afinidad se ha utilizado con fines prácticos desde 1951
Los componentes se separan de la siguiente manera:
- la solución de trabajo que contiene la sustancia a aislar se pasa a través del adsorbente;
- ligando depositado en la matriz sorbente retiene esta sustancia;
- se concentra (acumulación);
- extracción de la sustancia aislada del adsorbente mediante lavado con un disolvente.
Este método le permite aislar células completas. La diferencia con la cromatografía de sorción tradicional es que existe una fuerte unión bioespecífica del componente aislado al sorbente, que se caracteriza por una alta selectividad.
Adsorbentes
Las siguientes sustancias se utilizan como adsorbentes:
- Compuestos en gel a base de agarosa, un polisacárido obtenido del agar. Las más utilizadas son 3 variedades: sepharose 4B, CL (agarosa reticulada) y affi-gel. Esta última composición es un gel modificado de agarosa y poliacrilamida. Posee mayor inercia biológica, alta resistencia química y térmica.
- Sílice (gel de sílice).
- Vidrio.
- Polímeros orgánicos.
Para eliminar los obstáculos mecánicos durante el contacto del ligando, se utilizan sustancias adicionales para separarlo del transportador (péptidos, diaminas, poliaminas, oligosacáridos).
Equipo
El equipo de cromatografía de afinidad incluye las siguientes unidades principales:
- tanques de almacenamiento para la fase móvil (eluyente);
- bombas de alta presión para suministro medio (la mayoría de las veces alternativas);
- filtro para eluyentes de limpieza del polvo;
- dosificador;
- columna cromatográfica para separación de mezclas;
- detector para detectar componentes separados que salen de la columna;
- registradores de cromatograma y unidad de microprocesador (computadora).
Para reducir la cantidad de aire disuelto, primero se pasa helio a través de la fase móvil. Para cambiar la concentración del eluyente, se instalan varias bombas controladas por el programador. Las columnas cromatográficas están hechas de acero inoxidable (para mayores requisitos de resistencia a la corrosión), vidrio (opción universal) o acrílico. Para fines preparativos, su diámetro puede variar de 2 a 70 cm. En cromatografía analítica, se utilizan microcolumnas de Ø10-150 µm.
Para aumentar la sensibilidad de los detectores, se introducen en la mezcla reactivos que contribuyen a la formación de sustancias que absorben más rayos en la región ultravioleta o visible del espectro.
Metodología
Hay 2 tipos principales de cromatografía de afinidad líquida:
- Columna, en la que la columna se llena con una fase estacionaria y se hace pasar una mezcla a través de ella con un flujoeluyente La separación puede ocurrir bajo presión o bajo gravedad.
- Capa fina. El eluyente se mueve a lo largo de la capa adsorbente plana bajo la influencia de fuerzas capilares. El adsorbente se aplica a una placa de vidrio, varilla de cerámica o cuarzo, lámina metálica.
Las principales etapas de trabajo incluyen:
- preparación del adsorbente, fijación del ligando sobre el soporte;
- introducir la mezcla de separación en la columna cromatográfica;
- carga de fase móvil, unión de componentes por ligando;
- reemplazo de fase para aislar la sustancia unida.
Destino
La cromatografía de afinidad se utiliza para aislar los siguientes tipos de sustancias (el tipo de ligando utilizado se indica entre paréntesis):
- análogos de inhibidores enzimáticos, sustratos y cofactores (enzimas);
- sustancias bioorgánicas con signos de extrañeza genética, virus y células (anticuerpos);
- carbohidratos de alto peso molecular, polímeros de monosacáridos, glicoproteínas (lectinas);
- proteínas nucleares, nucleotidiltransferasas (ácidos nucleicos);
- receptores, proteínas transportadoras (vitaminas, hormonas);
- proteínas que interactúan con las membranas celulares (células).
Esta tecnología también se utiliza para obtener enzimas inmovilizadas, y su unión a la celulosa permite la producción de inmunoabsorbentes.
Cromatografía de proteínas de unión al ADN
El aislamiento de las proteínas de unión al ADN se realiza medianteheparina Este glicosaminoglicano es capaz de unirse a una amplia gama de moléculas. La cromatografía de afinidad de proteínas de este grupo se utiliza para aislar sustancias como:
- factores de iniciación y elongación de la traducción (síntesis de moléculas de ácido nucleico y proteínas);
- restrictasas (enzimas que reconocen ciertas secuencias en el ADN de doble cadena);
- ADN ligasas y polimerasas (enzimas que catalizan la unión de dos moléculas para formar un nuevo enlace químico y están involucradas en la replicación del ADN);
- inhibidores de la serina proteasa que desempeñan un papel importante en los procesos inmunitarios e inflamatorios;
- factores de crecimiento: fibroblastos, Schwann, endotelial;
- proteínas de matriz extracelular;
- receptores hormonales;
- lipoproteínas.
Dignidad
Este método es uno de los más específicos para el aislamiento de compuestos reactivos (enzimas y agregados más grandes - virus). Sin embargo, no solo se utiliza para aislar sustancias biológicamente activas.
Detección de anticuerpos en pequeñas cantidades, evaluación cuantitativa del ácido poliadenílico, determinación rápida de las masas moleculares de las deshidrogenasas, eliminación de ciertos contaminantes, estudio de la cinética de activación de la forma inactiva de la tripsina, la estructura molecular de los humanos interferones: esta no es la lista completa de estudios en los que se usa cromatografía de afinidad. El uso en la clínica se debe a sus ventajas como:
- Capacidad de limpieza efectivaproteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos. Difieren ligeramente en sus propiedades físicas y químicas y pierden actividad durante la hidrólisis, la desnaturalización y otros tipos de tratamientos utilizados en otros métodos.
- La velocidad de separación de las sustancias, la naturaleza dinámica del proceso.
- No se necesita una purificación enzimática especial ni una homogeneización de isoenzimas para determinar las constantes de disociación.
- Capaz de separar una amplia gama de sustancias.
- Bajo consumo de ligandos.
- Posibilidad de separación de sustancias en grandes volúmenes.
- Proceso reversible de unión de macromoléculas biológicas.
Esta técnica se puede combinar con otras, para imponer un campo adicional (gravitacional, electromagnético). Esto le permite ampliar las capacidades técnicas de la cromatografía.
Ingeniería enzimática
Gracias a este método, comenzó el desarrollo activo de una nueva rama de la biotecnología: la ingeniería enzimática.
La cromatografía de afinidad para el aislamiento de enzimas tiene las siguientes ventajas:
- obtener enzimas en grandes cantidades como resultado de menos tiempo, como resultado - su reducción de precio;
- la inmovilización de enzimas puede ampliar significativamente el alcance de su aplicación en la medicina y la industria;
- La asociación de enzimas con un soporte sólido insoluble permite estudiar la influencia del microambiente y la dirección de las reacciones, que juegan un papel importante en los procesos naturales y fisiológicos.
