PCR, o reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica de laboratorio sofisticada que se usa ampliamente en medicina y otros campos científicos. El diagnóstico de PCR en un momento se convirtió en un verdadero avance en la ciencia.
Descripción
La PCR cuantitativa es un tipo de PCR en tiempo real.
Esto se entiende como una variante de la PCR, en la que se registra constantemente la cinética de la reacción, lo que permite evaluar cualitativamente el contenido de secuencias específicas de nucleótidos de ADN en una mezcla molecular compleja.
El método de PCR cuantitativa se analizará con más detalle a continuación.
La esencia del análisis
Los métodos de cultivo y serológicos se utilizan con especial frecuencia para diagnosticar infecciones. Bajo el primero, se determinan los anticuerpos contra un patógeno infeccioso en el suero sanguíneo. En el segundo, se utiliza material biológico tomado de una persona enferma para sembrar un medio específico que sea favorable para el crecimiento de colonias de patógenos. Diagnóstico en ambosel caso puede durar días o semanas.
El examen PCR se puede realizar con diferentes materiales biológicos que se obtienen de una persona enferma. La sangre y otros medios y fluidos patológicos, fisiológicos y biológicos actúan como muestras. Puedes hacer PCR en heces u orina.
Las infecciones atípicas y virales se diagnostican con mayor frecuencia mediante PCR cuantitativa, ya que pueden no ser fáciles de diagnosticar debido a la naturaleza específica del proceso patológico que provocan. Para determinar tales infecciones, lleva tiempo, durante el cual comienzan a producirse anticuerpos en el cuerpo, determinados por métodos serológicos. Pero esto es inaceptable en algunos casos.
Método de realización
Método PCR: detección en laboratorio de la infección en muestras aisladas del paciente (in vitro).
Para llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa, se requiere un conjunto de reactivos especiales.
El material de prueba se introduce en tubos de ensayo con reactivos. Los tubos de ensayo se colocan en un aparato especial: un amplificador de PCR, que está diseñado para amplificar (aumentar el número) de los fragmentos de ARN o ADN deseados, el amplificador de PCR funciona en un modo cíclico. En cualquier ciclo, si las muestras contienen la secuencia de ARN o ADN del patógeno, entonces se acumulan más y más copias de las partículas de estos ácidos nucleicos en la solución. Puede determinar la presencia del patógeno y su cantidad en las muestras.
Tipos de PCR
El análisis cualitativo por PCR permite obtener el siguiente resultado:
- negativo cuando el patógeno de interés no se encuentra en las muestras;
- positivo si se encuentran secuencias en las muestras que son características de un patógeno en particular.
Con un resultado positivo de PCR, podemos hablar con un 95 % de precisión sobre la presencia de una infección diagnosticada. Al mismo tiempo, la precisión de los conjuntos de PCR utilizados con fines de diagnóstico alcanza el 100 %.
Por lo general, el factor humano determina el 5 % de los resultados incorrectos. Por ejemplo, las violaciones de la técnica de análisis y almacenamiento de reactivos pueden reducir significativamente la precisión del estudio.
La PCR cuantitativa define el concepto de carga viral. Es posible determinar cuántos conjuntos de ADN patógeno había en las muestras tomadas del paciente.
La gravedad de la infección es directamente proporcional al aumento de su número. También puede determinar el éxito de la terapia para reducir la carga viral.
Envío para PCR biomaterial
La PCR cuantitativa se realiza en la clínica, principalmente por la mañana. Durante una visita al médico, se le indicará al paciente lo que debe tomarse: raspado, frotis, orina o sangre. La PCR puede detectar patógenos independientemente del nivel de contaminación del material.
Para un análisis positivo, en teoría, se requiere la presencia de un solo patógeno en las muestras. En la práctica, intentan crear condiciones aún más favorables. Hay algunas recomendaciones para esto:
- si toman un raspado o hisopado de los genitalesórganos, debe abstenerse de tener relaciones íntimas tres días antes del estudio;
- no puede ducharse con medicamentos antibacterianos ni lavarse antes del análisis;
- tres horas antes de tomar una muestra de la uretra, debe tener paciencia y no vaciar los intestinos.
No sigas estas reglas al donar sangre.
¿Cómo se interpretan los resultados del análisis PCR cuantitativo?
Evaluación cuantitativa de los resultados obtenidos
En una serie de situaciones clínicas, aparece el problema de la eficacia del tratamiento y/o la dinámica del proceso patológico. Tales preguntas son especialmente relevantes cuando se examina a personas con infecciones crónicas (virus de la inmunodeficiencia humana, hepatitis B y C). A la hora de diagnosticar, se basan en que la acumulación de amplicones (productos de PCR) es proporcional a la presencia de copias del gen deseado en la muestra analizada.
Por supuesto, teniendo en cuenta los resultados de la PCR cuantitativa se realiza mediante electroforesis en gel con el estudio de la intensidad de las señales especiales de PCR. Además, un requisito previo para una correcta evaluación cuantitativa de los resultados obtenidos son muestras de control positivas y fiables que contengan un número conocido de copias del gen deseado (por ejemplo, mil copias del gen de la hepatitis C para una reacción de PCR). Varias diluciones en serie del control cuantitativo permiten generar curvas de calibración y se utilizan para evaluar el contenido de genocopias clínicas en muestras clínicas.
En la definición de PCR cuantitativa, un logro clave ha sido la creaciónsondas de ADN fluorescentes que se agregan a la mezcla de reacción simultáneamente con cebadores simples y le permiten rastrear el proceso de PCR en el tiempo, es decir, PCR en tiempo real.
La metodología TaqMan se refiere a la síntesis de sondas de ADN fluorescentes que son específicas de la parte media del amplicón y tienen dos etiquetas en los extremos. Uno de ellos es un marcador fluorescente, el segundo es una molécula extintora de esta fluorescencia.
Un dispositivo especial, que es un híbrido de un fluorímetro y un termobloque-amplificador, realiza mediciones constantes de fluorescencia en cada tubo de ensayo (principio de PCR en tiempo real). Después de 20-40 ciclos de PCR, se obtendrán curvas individuales para cada muestra. El número de copias del gen deseado que contiene la muestra de prueba se puede calcular a partir de las curvas de calibración con muestras de control.
Además, una característica importante de la implementación de la PCR por el método fluorescente es que no es necesario abrir los tubos con una mezcla de PCR cuando se tienen en cuenta los resultados. Esto reduce la posibilidad de contaminación de la sala con productos de amplificación y no es necesario asignar áreas de trabajo especiales para la electroforesis.
¿Qué muestra una transcripción de PCR cuantitativa?
¿Qué se está descubriendo?
A través de un método como la PCR cuantitativa, se encuentran cambios cualitativos en los genes: inserciones, deleciones y mutaciones puntuales. Pero con algunos trastornos hereditarios, los síntomas correspondientes aparecen en respuesta a un cambio en el contenido de ciertos genes.
GraciasEl análisis cuantitativo da un resultado numérico, con mayor frecuencia en UI/ml. Esto significa que en un mililitro de la muestra de prueba, se encontró un cierto número de copias del ARN o ADN del patógeno, medido en unidades internacionales.
Dependiendo de la magnitud, se diagnostica la gravedad de la infección. La sangre generalmente se analiza para determinar la carga viral, ya que los virus se mueven libremente en la sangre durante la enfermedad.
Características
La PCR cuantitativa en un análisis de sangre tiene dos características.
- El análisis se lleva a cabo en presencia de cebadores o trifosfatos de desoxirribonucleósidos, que se marcan con un marcador fluorescente o radiactivo para determinar con precisión el contenido del producto de PCR formado.
- En el proceso de PCR, finalice la reacción antes de que aparezcan demasiados productos de PCR. Esto se debe a que en la etapa final de saturación, cuando hay muchos productos de PCR, tanto la propia enzima como los sustratos actúan como enlaces limitantes de esta reacción. El final del siguiente ciclo de PCR en tales condiciones ya no se caracteriza por una duplicación del número de productos de PCR, se nivelan diferencias cuantitativas insignificantes entre diferentes muestras, que se definen con bastante claridad en las primeras etapas después de pasar por una serie de ciclos de reacción..
Coste del diagnóstico PCR
La investigación PCR tiene un costo, que depende de qué tipo de infección se probará, de la metodología de análisis y del material de prueba. Para determinar una infección, tendrá que dar dentro200-800 rublos. También se agrega una tarifa por tomar biomaterial: aproximadamente 400 rublos.
