La citometría de flujo es un método de investigación citológica que se utiliza para el análisis en profundidad de las células. Su ventaja es que te permite estudiar cada celda individualmente. Este tipo de análisis ayuda a evaluar varios parámetros en cientos de celdas en cuestión de segundos. Como resultado, la citofluorimetría se considera uno de los métodos de análisis más rápidos y precisos actualmente disponibles para científicos y médicos.
Principio
El principio de la citometría de flujo se basa en la medición de la dispersión de la luz y la luminiscencia (fluorescencia) de las células. La suspensión celular pasa como un flujo a alta velocidad a través de la celda del citómetro, donde se irradia con un láser. Allí también se realiza el llamado enfoque hidrodinámico. Su mecanismo es que el flujo de la celda con las partículas estudiadas a la salida desemboca en el chorro externo, que tiene una mayor velocidad. Como resultado, las partículas se alinean en una cadena ordenada.
Las precélulas se etiquetan con tintes fluorescentes especiales (fluorocromos). Gracias a ellos, el rayo láserexcita un resplandor secundario. Las señales luminosas recibidas son registradas por detectores. Posteriormente, la información se procesa utilizando algoritmos de software que le permiten contar poblaciones de células individuales que difieren en algunos criterios.
La investigación con microscopía convencional a menudo no logra distinguir entre diferentes células porque se ven iguales. La citofluorimetría puede proporcionar otros datos (integridad de la estructura del ADN), analizar la expresión de proteínas, la supervivencia celular.
Dado que la excitación de los fluorocromos requiere haces de luz con diferentes longitudes de onda, así como diferentes tipos de detectores, las instalaciones modernas están equipadas con varios canales de detección (de 4 a 30). El número de emisores láser puede ser de 1 a 7. Los dispositivos más complejos permiten estudios de múltiples parámetros de varias propiedades de las partículas a la vez.
Ventajas y desventajas
Los beneficios de la citometría de flujo incluyen:
- alta velocidad de procesamiento (registro de hasta 30 mil eventos en 1 segundo);
- posibilidad de estudiar un gran número de células (hasta 100 millones en una muestra);
- Cuantificación de la intensidad de la luz fluorescente;
- análisis de cada celda;
- estudio simultáneo de procesos heterogéneos;
- separación automática de datos por poblaciones de células;
- visualización de calidad de los resultados.
Otra característica de esta tecnología es quela partícula analizada se puede teñir con varias soluciones fluorescentes. Gracias a esto, se produce un estudio multiparamétrico.
Las desventajas incluyen la complejidad del equipo técnico y la necesidad de una preparación especial de la muestra.
Citómetros
Los primeros dispositivos de este tipo aparecieron ya en 1968 en Alemania, pero se generalizaron mucho más tarde. Actualmente, todos los dispositivos que funcionan por el método de citometría de flujo se pueden dividir en 2 tipos:
- dispositivos que miden la radiación fluorescente (dos o más longitudes de onda), dispersión de luz de 10° y 90° (detector de ángulo bajo y dispersión lateral);
- dispositivos que, además de medir varios parámetros celulares, clasifican automáticamente en grupos según estos criterios.
El detector de dispersión frontal está diseñado para determinar el tamaño de la célula, y el dispositivo de dispersión lateral le permite obtener información sobre la presencia de gránulos intracelulares, la proporción de volumen del citoplasma y el núcleo.
Los citómetros clásicos, a diferencia de los microscopios ópticos, no permiten obtener una imagen de una célula. Sin embargo, en los últimos años se han desarrollado dispositivos combinados que pueden combinar las capacidades de un microscopio y un citofluorímetro. Se discutirán a continuación.
Citómetros de imagen
Para instrumentos utilizados en citometría de flujo clásica,una característica es característica: si se registran eventos raros en la población de células analizadas, entonces no hay forma de evaluar cuál es su esencia. Estas partículas pueden ser restos de células muertas o un grupo raro de ellas. En los dispositivos convencionales, estos datos se excluyen del flujo general de eventos, pero son ellos los que pueden tener un valor particular para el análisis científico y clínico.
La nueva generación de citómetros de flujo de imágenes le permite capturar una imagen de cada célula que pasa en el flujo a través de la zona del detector. Es fácil verlo haciendo clic en el área correspondiente del diagrama, que se muestra en el monitor de la computadora.
Áreas de aplicación
La citometría de flujo es un método universal que se utiliza en muchos campos de la medicina y la ciencia:
- inmunología;
- oncología;
- trasplantología (trasplante de médula ósea roja, células madre);
- hematología;
- toxicología;
- bioquímica (medición de la acidez dentro de la célula, estudio de otros parámetros);
- farmacología (creación de nuevos medicamentos);
- microbiología;
- parasitología y virología;
- oceanología (el estudio del fitoplancton para evaluar el estado de las masas de agua y otras tareas);
- nanotecnología y análisis de micropartículas.
Inmunología
El sistema inmunitario humano consta de una amplia variedad de células. La citometría de flujo en inmunología permite evaluar su estructura y funciones, es decir, realizar análisis morfofuncionales.análisis.
Tales investigaciones ayudan a comprender la naturaleza compleja de la inmunidad. Los fenotipos celulares cambian como resultado de la activación por antígenos, el desarrollo de patologías y otros factores. La citofluorometría puede separar subpoblaciones de células inmunitarias en una mezcla compleja y evaluar todos sus cambios a lo largo del tiempo.
Oncología
Una de las tareas más importantes en oncología es la diferenciación de las células según su tipo. El principio del análisis por citometría de flujo en oncohematología se basa en el siguiente fenómeno: cuando una muestra se trata con un colorante fluorescente especial, se une a proteínas citoplasmáticas. Después de la división en células que proliferan activamente, su contenido se reduce a la mitad. En consecuencia, la intensidad de la luminiscencia celular se reduce al doble.
Hay otras formas de detectar células en proliferación:
- uso de colorantes de unión al ADN (yoduro de propidio);
- uso de uracilo etiquetado;
- registro de un mayor nivel de expresión de las proteínas ciclinas, que intervienen en la regulación del ciclo celular.
